試劑盒優(yōu)化的具體表現(xiàn)
免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic technique)也叫酶免疫測定,是通過酶標(biāo)記抗體或抗原來檢測抗原或抗體的方法,其應(yīng)用范圍極廣。顯示方法是用酶的特殊底物來處理反應(yīng)后的標(biāo)本,通過酶催化底物的顯色反應(yīng)來測定抗原或抗體的存在,以酶標(biāo)作定量或定性分析。
近年來,EIA技術(shù)取得了顯著的發(fā)展,主要表現(xiàn)在以下方面:
1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應(yīng)用,明顯地提高了檢測的特異性,基本消除了抗原、抗體間的非特異xing jiao叉反應(yīng),保證了分析的準(zhǔn)確性??贵w制備技術(shù)的進(jìn)步,使試劑的生產(chǎn)制備得以規(guī)模化,檢測范圍日益擴(kuò)展,小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。
2、分析方式的改進(jìn)與多樣化提高了試驗的敏感性。
(1)除早期的競爭法,間接法外,又發(fā)展了雙抗原夾心法測抗體,偶聯(lián)酶標(biāo)記法測抗原,橋聯(lián)酶免疫分析,酶放大免疫分析技術(shù)等,后者應(yīng)用了生物素-親和素系統(tǒng),底物循環(huán)放大系統(tǒng),酶-抗酶放大系統(tǒng)及酶偶聯(lián)放大系統(tǒng)等。
(2)由于酶標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步,標(biāo)記酶的應(yīng)用已從過氧化物酶,擴(kuò)展到堿性磷酸酶,β半乳糖苷酶,尿素酶,葡萄糖6磷酸脫氫酶,葡萄糖氧化酶,蘋果酸脫氫酶,至今有二十多種酶被應(yīng)用于EIA ,但應(yīng)用比較多的仍然是辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephasphotase,ALP)。
(3)酶免疫分析與其它標(biāo)記免疫分析相結(jié)合如與熒光免疫分析(Fluorescence Immunoassay ,FIA)結(jié)合形成熒光酶免疫分析(Fluorescence Enzyme Immunoassay ,F(xiàn)EIA),酶促放大時間分辨熒光免疫分析(Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ,EATRFIA),EIA與化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)結(jié)合形成酶—化學(xué)發(fā)光免疫分析,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(ECLEIA)。EIA與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合形成的PCR-EIA分析等。
(4)改進(jìn)固相載體的技術(shù)
傳統(tǒng)ELISA應(yīng)用的固相載體是聚苯乙稀微孔板,聚苯乙烯珠或條,后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結(jié)合容量,增加結(jié)合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面,如用化學(xué)偶聯(lián)法導(dǎo)入功能性醛基、?;?、烷胺基等以更好地與蛋白質(zhì),多肽的羧基結(jié)合,用位點導(dǎo)向性共價偶聯(lián)法引入親和素,蛋白A,多聚賴氨酸等,以牢固地捕獲蛋白或多肽,超平整聚苯乙烯表面的制備,克服了表面粗糙帶來的不均一性,達(dá)到平均粗糙度只有2A+的超平整平面,實現(xiàn)了對蛋白的結(jié)合容量大,脫附率低,孔間均一性好,使試驗精密度達(dá)5%。
應(yīng)用于雙抗體夾心法時,聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,可以增加其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化酶標(biāo)板,其質(zhì)量達(dá)到氨基活化相似水平。
(5)分析方法的創(chuàng)新 如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上,蓋上釘板的同時與微孔內(nèi)的所需標(biāo)本、試劑反應(yīng),是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復(fù)合物的特性,將常規(guī)二步溫育法改為一步溫育測定法,使檢測時間大為縮短,現(xiàn)在已廣為應(yīng)用。